Итоговая аннотация по проекту "Разработка методологии и создание средств контроля для оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности"

Номер контракта: 01.648.12.3004
Дата: 25.09.2008 –  15.05.2011
Головной исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН
Соисполнители:

Открытое акционерное общество «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроогрганизмов»

Общество с ограниченной ответственностью «ЭкоБиоФарм»

Общество с ограниченной ответственностью «Хеликон Аналитика»

Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженения» РАН

Государственное учебно-научное учреждение «Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова»

АННОТАЦИЯ ПРОЕКТА

Тема: «Мероприятия по информационно-аналитическому обеспечению работ и экспериментально-техническое обоснование моделей для оценки и контроля действия наночастиц и наноматериалов (НЧ и НМ) на аппарат наследственности»

Работа по проекту проводилась в 7 этапов с 2008 по 2011 гг.

Цель работы: создание комплекса методов и соответствующих им протоколов для контроля действия наночастиц и наноматериалов на аппарат наследственности, позволяющего на основании этой информации принимать решения по обеспечению безопасности системы передачи наследственных признаков.

2008 г.

На I этапе «Мероприятия по информационно-аналитическому обеспечению работ и экспериментально-техническое обоснование моделей для оценки и контроля действия наночастиц и наноматериалов (НЧ и НМ) на аппарат наследственности» были подготовлены аналитические обзоры подходов к контролю сохранности наследственной информации, основанных на использовании 6-ти различных экспериментальных моделей. На основании полученных данных были проведены работы по экспериментально-техническому обоснованию выбора моделей и средств аналитического контроля для дальнейшей разработки методологии оценки действия наночастиц и наноматериалов на аппарат наследственности.

Полученные результаты представляют собой исходные данные для дальнейшего развития методологии оценки воздействия наноматериалов на аппарат наследственности и предназначены для обоснования выбора комплексного подхода к решению задачи по контролю безопасности наночастиц с позиции сохранения наследственной информации. Результаты работы могут быть использованы для предварительной оценки экономических затрат, связанных с дальнейшим внедрением разработанных методик.

В ходе реализации II этапа «Испытания режимов детекции масс белковых биополимеров в диапазоне до 150 кДа» были получены следующие результаты:

- программа и методика испытаний режимов эксплуатации высокомолекулярного детектора белковых биополимеров в диапазоне масс до 150 кДа;

- протокол испытаний масс-спектрометрического оборудования, подтверждающий соответствие метрологических характеристик требованиям к диапазону масс (до 150 кДа), погрешности детекции масс (ниже 250 м.д.), разрешающей способности (выше 3000 ед.) и чувствительности (до 10-9М).

Разработана программа и методика испытаний специальных режимов эксплуатации масс-спектрометрического оборудования в диапазоне детектируемых масс до 150 кДа. По показателю чувствительности данный режим в 12 раз превышает использовавшийся до этого эксплуатационный режим прибора. В результате проведенных испытаний установлено, что режимы эксплуатации масс-спектрометра пригодны для выполнения измерений в высокомолекулярном диапазоне масс до 150 кДа с погрешностью детекции масс не превышающей 250 м.д. и с чувствительностью не ниже 10-9 М в биоматериале. Методика выполнения измерений в высокомолекулярном диапазоне может использоваться для получения информации о белковом составе образцов печени.

На III этапе «Разработка основных положений методик проведения аналитических измерений/наблюдений для оценки действия наночастиц и наноматериалов на аппарат наследственности» в результате выполнения отчетного этапа работ были сформулированы основные положения методик выполнения экспериментов, включая 8 методик выполнения наблюдений и 4 методики выполнения измерений. Проекты методик были разработаны с учетом положений «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» и требований ГОСТ Р 8.563-96 «Методика выполнения измерений».

Основные положения разработанных методик, представленных в составе научно-технического отчета, включают: краткое изложение принципа методики, описание схемы постановки эксперимента, перечень контролируемых в ходе эксперимента параметров и способов их формализованного описания, подготовку экспериментальных животных или приготовление биологических образцов, порядок выполнения наблюдений за животными в ходе эксперимента, выполнение измерений молекулярного состава биологических образцов, статистическую модель обработки данных и алгоритм принятия итогового решения. Основу интегральной схемы выполнения экспериментов составляют четыре параллельные группы процессов, первая из которых – это «опыт», то есть воздействие наночастицами на объект исследования, и три последующих – контрольные: «интактный контроль», «контроль растворителя» и «позитивный контроль». Формат итогового решения содержит ссылку на значения зафиксированных в ходе эксперимента нормированных характеристик и заключение об острой токсичности, эмбриотоксичности, генотоксичности, тератогенности и токсическом влиянии на ранние стадии развития организма. В ходе разработки основных положений методик были выполнены пилотные эксперименты, позволившие определить требования к номенклатуре и качеству используемого измерительного оборудования, вспомогательным техническим средствам и расходным материалам. В частности, в результате экспериментов, выполненных на эмбрионах мышей в режиме позитивного контроля, были установлены статистически значимые отклонения в развитии эмбрионов от нормы по таким нормированным параметрам как фрагментация, компактизация, дегенерация и отставание в развитии. Эксперименты с тканями рыб вида Данио выполнялись в режиме интактного контроля и позволили идентифицировать 14 белков, экспрессируемых в печени в нормальных условиях. Для каждого белка были нормированы две метрологические характеристики – достоверность идентификации и степень перекрытия первичной структуры идентифицированными пептидами. Результаты экспериментов приведены в отчете как примеры заполнения отчетных форм документирования.

Результаты, полученные на этапе, пригодны для широкого применения в области обеспечения биобезопасности и экологического мониторинга. Разработанные методики могут применяться также в области испытаний лекарственных препаратов, созданных с применением (или на основе) наночастиц.

2009 г.

Особенность методологии проведения работ IV этапа «Разработка средств контроля действия НЧ и НМ на аппарат наследственности и утверждение типовых форм документирования результатов измерений» заключается в том, что была предложена универсальная схема разведения стокового раствора наночастиц с тем, чтобы получить оптимальные условия для оценки их патогенного воздействия. За отчетный этап были разработаны лабораторные регламенты на все элементы методологии. Были выполнены эксперименты по разработке схемы дозирования раствора наночастиц, которые включали в себя измерение подвижности сперматозоидов. Были полностью апробированы регламенты, связанные с проведением молекулярного анализа, в том числе получены протеомные профили эмбрионов рыб вида Данио, состоящие из 25 белков. Подобраны условия подготовки и нанесения биоматериала на микроматрицы ДНК. Выполнены пилотные эксперименты по ферментации штамма бактериального биосенсора. Подготовлены группы животных для выполнения экспериментов по оценке. Проведена верификация сток-растворов доксирубицина в составе фосфолипидных наночастиц. Отработана методика растворения фуллеренов С60. Полученные на этапе результаты работ обеспечивают основной пакет регламентирующей документации в составе методологии контроля для оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности. Методики поверки оборудования могут использоваться отдельно в области исследований по молекулярной биологии и в сфере биомедицины.

На V этапе «Доработка комплекса методик для оценки действия наночастиц и наноматериалов на аппарат наследственности, проведение параллельных измерений (наблюдений) в ограниченном масштабе – на образце сравнения и не более чем двух ОАК» проведена доработка и оптимизация методик оценки влияния наночастиц и наноматериалов на аппарат наследственности. Разработка методик осуществлялась по двум направлениям: исследования на молекулярно-генетическом и на организменном уровне. Тестирование показало высокую чувствительность разработанных методик. Методика оценки действия токсикантов на сперматозоиды млекопитающих (быка) предполагает оценку действия тестируемого вещества на полностью генетически неактивные живые клетки, и показывает наличие негативных эффектов всех исследуемых веществ разной степени выраженности. Оценка действия объекта аналитического контроля доксолипа (наночастицы в форме липосом с доксорубицином) на аппарат наследственности бактериальной клетки с применением биосенсоров E. coli, свидетельствует о генотоксичности объектов аналитического контроля (ОАК). Установлен порог токсичности концентрация ОАК, вызывающий повышение интенсивности флуоресценции более чем в 1,5 раза.

Разработанная ДНК-микроматрица человека представляет собой стеклянную подложку с нанесенными на нее зондами. В качестве зондов используются ВАС клоны из генома человека, которые равномерно покрывают геном и исключают повторы. Для расчета зондов была выбрана библиотека человеческих ВАС клонов RP11. Общее число клонов составило 4800.

Масс-спектрометрическое профилирование белков эмбрионов рыб вида Danio rerio после воздействия ОАК показывает достоверное различие протеомных профилей гомогенатов в контроле и после воздействия токсическими соединениями.

Методика определения повреждающего действия токсикантов (в т.ч. наноматериалов) в лабораторных условиях с использованием эмбрионов шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin) позволяет оценить биобезопасность веществ в водной среде при действии на активно работающий геном in vivo.

Преимплантационные эмбрионы млекопитающих (мышь) являются чувствительным объектом, сочетающим в себе возможности как цитологической, так и морфологической модели. Они демонстрировали высокую чувствительность к биологическим свойствам протестированных ОАК.

2010 г.

На VI этапе «Тестирование методологии оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности путем проведения параллельных измерений (наблюдений) на ОАК» доработаны и апробированы методики оценки генотоксичности TiO2, фуллеренов, фосфолипидных наночастиц. Тестирование показало высокую чувствительность разработанных методик. Предварительное тестирование острой токсичности наноматериалов по реакции зрелых мужских половых клеток in vitro свидетельствует о том, что 10-ти и 100 нм частицы TiO2, в суспензиях не влияют на двигательную активность сперматозоидов. Необходимо проводить дальнейшие эксперименты, совершенствуя способ приготовления суспензии для увеличения сроков контакта препарата в виде наночастиц с тест-объектом. Оценка действия объекта аналитического контроля TiO2 (размерами 10, 20, 100 нм) на аппарат наследственности бактериальной клетки с применением биосенсоров E. coli, свидетельствует о генотоксичности ОАК в концентрации 1,5 мг/мл при инкубации более 0,5 часа под ближним ультрафиолетом 340-380 нм. Масс-спектрометрическое профилирование белков эмбрионов рыб вида D.rerio после экспозиции в течение 48 часов в исследуемых концентрациях (фуллерены С60 в концентрации 4,7 мкг/мл и TiO2 (20 нм) в концентрации 50 мкг/мл) показывает отсутствие токсического эффекта. Однако предложенная нами методика оценки токсичности НЧ и НМ (фуллеренов С60) позволяет регистрировать ранние изменения протеома эмбрионов (появление CYP2K6 и исчезновение Wilms tumor protein WT1), которые при более длительной экспозиции могут привести к токсическому проявлению на уровне фенотипа Danio rerio. Оценка действия различных по размеру частиц TiO2 (10, 20, 100 нм) на эмбрионы и взрослые особи D.rerio показывает отсутствие токсических эффектов для данной модели.

При тестировании методики оценки острой токсичности наночастиц и наноматериалов с использованием эмбрионов шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin) обнаружены токсические эффекты ОАК (доксолипа, липофуллерена), которые выражаются в практически полной гибели зародышей и в наличии достаточно большого количества аномалий развития, преимущественно выражающихся в нарушении адгезии клеток (посыпавшиеся клетки) и выростов на поверхности зародыша.

Тестирование фосфолипидной транспортной системы, экспериментального препарата липофуллерен и доксолип с использованием преимплантационных эмбрионов млекопитающих (мышь) показало два вида отказов работы метода. В первом случае все эмбрионы выживали во всех сериях, что говорит о «несоответствующей токсичности вещества позитивного контроля». Данный отказ был устранен приготовление новых партий маточного и стокового растворов и повторной постановкой эксперимента. Второй отказ работы метода, соответствующий ситуации «общий отказ системы», связан с бактериальной контаминацией культуральной среды. Для устранения выявленного отказа работы метода была произведена замена культуральной среды.
При анализе результатов  введения ОАК с 1 по 17 день беременности, т.е. в антенатальный период, у эмбрионов мыши линии СВА обнаружены следующие эмбриотоксические эффекты: статистически достоверное повышение количество центров оссификации скелетов, в том числе повышение центров оссификации стоп; тенденция повышения частоты случаев нарушения развития головного мозга, патологий печени и кровоизлияний в грудную и брюшную полость, вызванных  введением ОАК; увеличение морфометрических характеристик (длина, масса) плодов по сравнению с контрольной группой. Незначительность наблюдаемых проявлений позволяет сделать  заключение о высокой вероятности отсутствия эмбриотоксического действия у фосфолипидной транспортной системы и о критической чувствительности к этому токсическому воздействию тест-обьектов в летний период.

Разработанная методика профилирования может широко использоваться для изучения молекулярного ответа как на наночастицы, так и на другие вещества, в том числе токсичные агенты и лекарства. На основе данной методики могут быть созданы технологии скринингового выявления побочных эффектов новых препаратов и промышленных материалов.

Полученные результаты будут использованы для создания комплексной системы оценки токсичности наночастиц и наноматериалов.

2011 г.

На VII этапе «Создание унифицированного (единого) протокола проведения комплексной оценки влияния НЧ и НМ на аппарат наследственности» установленные в результате комплексного тестирования на эмбриональных объектах токсические эффекты тестируемого препарата КТ CdSe/ZnS-DHLA можно объяснить наноформой комплекса веществ, входящих в состав образца. С целью адаптации методик, основанных на молекулярно-генетических методах, для исследований фотоактивных наноматериалов диоксида титана, проведена апробация на базовых биосенсорных штаммах, и штаммах, мутантных по генам окислительного стресса и генам, кодирующим белки, репарирующие окислительные повреждения ДНК. Показано, что штаммы, мутантные по генам oxyR, xthAи mutM,подвержены слабо выраженному генотоксическому воздействию наночастиц TiO2. Значимые различия в чувствительности биосенсоров к указанным наночастицам, или в величине эффекта активации SOS-ответа в зависимости от базового биосенсорного штамма, установлены не были.

Научно-технический уровень выполнения работ: впервые проведено протеомное профилирование модельного организма вида данио, а разработанная методика измерения токсичности наночастиц и наноматериалов методом масс-спектрометрического профилирования белков эмбрионов рыб вида данио рерио, аттестована и зарегистрирована в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений. Данная методика также применяется для исследования молекулярных механизмов воздействия наночастиц.

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии

имени В.Н. Ореховича РАМН